免疫组化实验步骤

基本原理：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

1.1组织标本的处理

1）将组织块大小约为（1×1×1cm）的组织样本放入10%的中性福尔马林溶液中，等固定48h后，将组织取出对组织面进行修整并放入包埋盒中

2）利用自动脱水机对包埋好的组织样本进行脱水处理

3）取出已经脱水完的组织，将组织外围的石蜡溶解，将脱蜡的组织块以最大切面朝下放入铅制模具中，加入石蜡将组织完全包埋，盖上底板，置于冰上冷却，放入-4℃冰箱

4）调整切片机，对石蜡包埋的组织进行修片

5）将切片厚度设置为3μm/片，进行切片，右手连续转动操作杆待出现3-4个折叠蜡片后，用左手持毛笔，笔尖轻触完整蜡片下沿，慢慢的向后引导和拉伸蜡片，并且右手同时进行连续切片，尽量协调左右手使得蜡片连续不中断

6）直至所需蜡片长度后，用右手持镊子轻轻夹到蜡片尾端，缓慢的将蜡片由远端向近端平铺于摊片机后，在连接处分段，进行摊片和捞片（摊片机温度设置）

7）捞好的片子置于玻片架上，保存于4℃冰箱

1.2 免疫组织化学染色

1.2.1 脱蜡、水化（组织脱水的目的是通过酒精的媒介让有机溶剂渗透入组织，再让石蜡置换有机溶剂，从而使组织包埋在石蜡中。水化是组织切片经二甲苯脱蜡后，用酒精洗去二甲苯，所以必须从高浓度酒精开始，然后再利用酒精的媒介入水。）

1）将4℃保存的切片取出，转移至金属切片架中，放入70℃恒温烤箱中，烤片90min（使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固贴在玻片上。）

2）烤片结束后，立即将切片放入二甲苯I脱蜡10min

3）转移至二甲苯II脱蜡10min

4）过梯度酒精（100%-95%-80%）各5min

5）在装有自来水的缸中洗三遍，每次洗完后换上新的自来水

6）在纯水中洗涤，上下涮洗15次，每次洗涤完换水重复3次，洗涤完后转移至3%H2O2中浸泡10min，再过3次纯水（内源性过氧化物酶会与基质溶液（过氧化氢和显色剂，例如DAB）发生反应，导致假阳性。在与HRP偶联抗体一起孵育之前，先用过氧化氢预处理样本可以显著降低这种非特异性背景。有效降低内源性过氧化物酶导致的非特异性染色）背景性太强：原因一

1.2.2 抗原修复（组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连，导致许多抗原决定簇被封闭）

7）将切片放于装有0.01M柠檬酸缓冲液（pH6.0±0.1）的高压锅中，进行高压修复2.5min，然后转移到冷水中冷却（自然冷却？？温度剧降可能引起脱片，同时高温中的抗原蛋白分子链脱离了其他的束缚或联结，会慢慢地恢复原来的形态和构型）（修复时间过长可能会使染色背景加深，缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。）

8）等待冷却期间配PBS液1：1000（纯水）

9）稀释抗体（一抗）（背景性太强：原因二，一抗浓度过高，一抗与非靶向的抗原表位的非特异性结合，降低一抗浓度或者增加封闭液浓度）（目标蛋白的结合太弱：一抗上的抗原决定簇与细胞上靶抗原的亲和力很弱，可能因为组织切片长期保存而使其蛋白降解或变性。）

10）过3次纯水（上下涮洗15次），然后用PBS洗涤3次（每次5min)

1.2.3 孵育抗体

11）血清封闭：将切片放入准备好的于一抗具有相同种源的血清中，室温封闭15-30min。封闭完后倾去封闭液

12）将稀释好的一抗滴加在切片组织之上，将切片置于4℃过夜孵育一抗。孵育完后，回收一抗，然后用PBS冲洗，3min×5次

13）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30min至1h，PBS冲洗，3min×5次（背景性太强：原因三，二抗与细胞上类似的抗原表位具有强的亲和力而非特异性结合，如果封闭血清跟二抗来自同一种属，那么稍微增大血清浓度至2%以上。如果用BSA或脱脂奶粉封闭，那么就可用与二抗同一种属的血清。）

14）DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度

15）自来水充分冲洗10min

1.2.4 复染（目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，苏木素复染（胞核染料）细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色，苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色

16）苏木素染色：苏木素染液染15s，如果染色液用了多次在使用前必须除去染色液中的金色杂质

17）自来水洗片至水转清

18）用1%盐酸分化，一般处理3s左右，具体处理时间根据染色的深浅，处理完后置于显微镜下观察细胞核染色的程度（苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明）因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度

19）用自来水冲洗4-5次

20）放入碳酸锂（返蓝液）中反蓝处理2s（分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用）

21）反蓝后放回水中继续洗15min。

1.2.5脱水，封片

22）置于85%酒精中5min，95%酒精中5min，100%酒精中5min

23）二甲苯两缸各10min

24）于通风橱中风干二甲苯

25）中性树胶封片