免疫荧光（ImmunofluorescenceIF）实验步骤

基本实验步骤：

（1） 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（2） 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min.

（3） 通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

（4） 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.

（5） 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.

（6） 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

（7） 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

（一）细胞准备

用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（二）固定和通透

除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三：

①防止细胞从玻片上脱落；

②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；

③使标本易于保存。

标本的固定原则是：

①不能损伤细胞内的抗原；

②不能凝集蛋白质；

③应保持细胞和亚细胞结构；

④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。