免疫共沉淀（CoIP）实验注意事项

CoIP是在IP实验的基础上进行的扩展，主要用于蛋白之间的互作研究。常被用于鉴定特定蛋白复合物中已知或未知的蛋白组分。其原理是基于抗体与抗原（靶蛋白）之间的特异性结合，此时如果样品溶液中存在能与靶蛋白相互作用的目的蛋白，会一同被拉下来，随后利用SDS-PAGE，Western Blot等方法对得到的目标蛋白进行分析，进而证明两者间的相互作用。

CoIP可行性注意事项：

1.可能难以检测到低亲和力和瞬间结合的蛋白质相互作用。

2.需要在实验前已知能与A蛋白结合的目的蛋白B是什么，才能选择合适的抗体保证用A蛋白抗体沉淀下来的蛋白复合物中能检测到B。如果不确定与A结合的蛋白是什么，或者有多种蛋白与A结合时，可通过质谱对沉淀产物进行后续鉴定来获取未知蛋白质的种类。

3.单纯的实验结果阳性并不能直接证明两种蛋白之间存在直接结合作用，也可能存在其他蛋白在其中充当了桥梁。因此需要设计更完善的实验方案，并进行正向与反向验证，最终证明这一结果。

CoIP实验注意事项：

1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（Np40或Triton x-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定；

2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用；

3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 ， 兔多克隆抗体：正常兔IgG；

4）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

5）要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

6）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。