ELISA空白背景高的原因和处理方法

1）洗板不干净

解决方法：

①充分洗涤：如果洗板的时间不够，会导致抗体残留，阴性对照会显色，尝试延长洗板时间，增加洗板频率，在洗液中添加表面活性剂Tween-20。

在洗板时要保证每步都洗涤完全，充分拍板直至孔内没有明显的残留液体。

②避免交叉污染：弃去洗液和孵育的抗体时避免交叉污染，移液枪头尽可能一次性使用，拍板的滤纸不要反复使用。

2）显色液变质或者试剂过期

解决方法：检查试剂盒有效期，或使用新的试剂盒并按照说明书要求保存试剂盒。每次用剩下的显色液最好不要回收，或者只回收洗净的容器装的显色液。

3）试剂稀释有误，检测抗体/酶结合物工作液浓度过高

解决方法：按照说明书推荐的稀释倍数稀释抗体。

4）试剂盒组分未平衡

解决方法：试剂盒每个组分都需要平衡至室温后进行实验。

5）混用其他试剂盒试剂

解决方法：保证使用试剂盒内完整的一套试剂进行实验，不同品牌及不同批次间的试剂可能存在不匹配现象，不同批号的试剂不要混用。

6）蒸馏水受酶等污染

解决方法：使用新鲜蒸馏水。

7）培养箱温度超过37℃或反应时间过长

解决方法：孵育时间过长、温度过高可能会导致非特异性结合增加，从而造成本底增高。检查恒温箱，确保孵育温度稳定在37℃，按照说明书的反应时间进行孵育。

8）酶标板底部有污渍

解决方法：在加完终止液之后，检测之前，用75%乙醇浸润的脱脂棉球擦拭酶标板底部，确认没有污渍之后再检测。

9）洗液被污染

解决方法：洗液现配现用，长期放置会析出，也可能会污染，导致背景偏高。

10）包被的抗原被污染

解决办法：仔细回想操作过程，换新的抗原包被。

11）封闭液、封闭时间、封闭液的浓度

解决办法：封闭液（BSA）可能会与抗体产生交叉反应。封闭液的浓度偏低、封闭时间过短导致封闭不彻底，抗体与酶标板结合，可能也会导致背景偏高，因此可以适当调整封闭液的浓度和时间以降低背景。

12）抗体质量差或选择的抗体不合适

解决办法：抗体质量不高，特异性不好可能会与封闭液（BSA）产生交叉反应，可以用0.8%明胶（明胶不含有血清成分）代替。

若选择多克隆抗体孵育，可能会与酶标单抗产生交叉反应，导致背景增加，最好选用与酶标单抗同种属的多克隆抗体。

13）酶标仪设置参数有误

解决办法：检查酶标仪设置的波长，不同波长下样品的吸光光度值也会有很大的差别，按照说明书要求设置参数。

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