免疫共沉淀实验流程

通过免疫共沉淀确定未知结合蛋白

该实验的思路为：先通过免疫共沉淀实验，得到结合蛋白，随后对得到的结合蛋白进行测序。

用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；

将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15min；

收集上清（约30 ml）并加入30 μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h；

加入0.9 ml的琼脂糖蛋白A悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min；

用含900 mmol/L NaCl的NETN洗琼脂糖蛋白A混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次；

吸出混合物的液体部分。加入800 μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min；

将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜；

通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；

从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min；

用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再进行电洗脱；

通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽进行Edman降解测序。

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