琼脂糖凝胶配置

一、原理

DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作用下朝正极移动。

在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。

溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。

二、材料、仪器设备及试剂

1）材料：分子量不同的DNA片段。

2）仪器设备：

1. 电泳仪；

2. 紫外检测仪；

3. 水平电泳槽；

4. 移液器；

5. 一次性手套。

3）试剂：

1. pH8.3 Tris-硼酸-EDTA缓冲液：称取10.78gTris，5.500g硼酸，0.930gEDTA-Na2溶于无离子水，定容到100ml，用时稀释10倍；

2. EB溶液：溴化乙锭（10mg/ml）（用时稀释10倍）；

3. 加样缓冲液：50%甘油+0.25%溴酚蓝；4. 琼脂糖。

三、实验步骤

1）琼脂糖凝胶的制备：

1. 称取琼脂糖1g，加入10倍电泳缓冲液10ml，再加入蒸馏水90ml，在电炉上加热溶解，配制成1%琼脂糖凝胶；

稍凉后加入配好的EB溶液数滴。

2. 将电泳模板两端密封，倒入琼脂糖凝胶溶液，插入梳子。

3. 冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中。

2）加样：

取样品溶液20μl，加入1/5体积加样缓冲液，混匀后，将溶液加到样品孔中，同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。

一般DNA样品最好控制在0.5～1.0μg之间。

3）电泳：加入pH8.3Tris-硼酸-EDTA缓冲液，通电维持2～4V/cm，电泳至溴酚蓝走到胶底部边缘时停止电泳。

4）染色及观察：电泳完毕，取出凝胶模具，将其推到一块干净的玻璃板上，于254nm或300nm波长紫外灯下观察，DNA存在的位置呈现橙黄色荧光，放置时间超过4～6h后荧光减弱，因此应立即用用国产全色胶卷拍照，并应加上红色滤色镜。

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