细胞复苏的主要步骤及注意事项

一、主要步骤：

①将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，细胞融化后要尽快(约1min)移出37℃水浴。37℃水浴时间延长会提高细胞死亡率，复苏过程中一般细胞死亡率在20%～25%之间。

②迅速用酒精棉球擦拭冷冻管外部杀菌消毒，然后放置在冰浴上。

③小心开启瓶盖，把细胞转入含有4mL培养基的培养瓶中，然后把培养瓶移至培养箱，36℃～38℃培养1h，让细胞贴壁。

④细胞贴壁后，小心移弃培养基，主要是去掉DMSO(悬浮生长细胞要通过离心沉淀除去DMSO)、死细胞及其碎片，加5mL新鲜培养基，36℃～38℃培养。

⑤细胞培养24h后，更换新鲜培养基，继续培养直到形成单层，便可以传代。

⑥详细记录复苏细胞的名称、数量、复苏时间、存放部位等。

二、注意事项：

1、注意无菌操作。

2、应在1-2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。另外，细胞复苏后的操作最好在4℃冰浴中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。

3、细胞复苏过程中，升温的速率要大，把从液氮或-70℃冰箱中取出的细胞在最短的时间内放入水浴锅。

4、细胞放入水浴中注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，并防止水浴时水进入细胞冻存管污染细胞。打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。

5、液氮操作有一定的危险性，打开液氮罐取出细胞时，戴上防护眼镜。

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