红细胞裂解液操作步骤

操作步骤：

（一）贴壁培养细胞

1、取NP-40裂解液置于室温融解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为1mM。

2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的NP-40裂解液，移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于细胞1～3s内，细胞就会被裂解。

4、10000～12000g，4℃离心5～10min（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

5、后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

（二）悬浮培养细胞

1、取NP-40裂解液置于室温融解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μl含PMSF的NP-40 裂解液。如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

4、10000～12000g，4℃离心5～10min（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

（三）组织样本

1、把组织剪切成细小的碎片，越小越好。

2、取NP-40裂解液置于室温融解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织，迅速研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。

4、按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液，冰上或4℃裂解30～60min。

5、步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。

6、10000～12000g，4℃离心5～10min（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

7、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事项：

1. 为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。建议将其适当分装成合适的量，然后置于-20℃保存。

2. 细胞裂解蛋白提取的所有操作步骤都需在冰上或4℃进行。

3. 建议在临用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。PMSF可以向我公司订购。

4. 在贴壁培养细胞的操作步骤中，去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

5. 如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

6. 在培养细胞的裂解中，如果细胞量较多，必需分装成50~100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

7. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器或研磨设备，缺点是不如使用匀浆器或研磨那样裂解得比较充分。

8. 如果希望获得更好的裂解效果，细菌和酵母可以分别使用溶菌酶和破壁酶消化，然后再使用本裂解液进行裂解。

9. 复融后的试剂请及时使用，避免裂解液中有效成分失效。

10. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

11.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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